Modelos agrícolas baseados em processos são ferramentas importantes que podem simular o crescimento de planta, sintetizando processos fisiológicos através de dados de entrada, onde é possível simular o melhoramento genético através das respostas da planta, além das características edafoclimáticas e de manejo da planta estudada. O objetivo desse projeto será então calibrar o modelo CROPGRO-Perennial Forage/DSSAT para o capim-elefante (Pennisetum purpureum Schum. cv. Cameroon). A biometria e a composição morfológica do capim-elefante já foi coletada em dois anos de experimento e será utilizada para o entendimento da partição e para calibração do modelo CROPGRO-Perennial Forage (CROPGRO-PF)/DSSAT. A calibração irá permitir então resultados mais acurados sobre o acúmulo de matéria seca e partição da planta de capim-elefante (Pennisetum purpureum Schum. cv. Cameroon) em Piracicaba, São Paulo, Brasil. Com modelo calibrado o segundo objetivo é avaliar a influência do fenômeno El Niño Oscilação Sul e suas fases, El Niño (EL) La Ninã (LN) e neutros (N) no acúmulo de forragem deste capim.

A 6-nitrodopamina (6-ND), produto da nitração dependente de óxido nítrico (NO) da dopamina (DA), é produzida endogenamente e crescentes evidências mostram seu papel como o mais potente mediador do cronotropismo in vivo e in vitro em ratos, e da atividade espasmogênica do canal deferente de ratos e humanos. Em outros tecidos do trato geniturinário a produção, liberação e função da 6-ND ainda é desconhecida. Este estudo busca ampliar a compreensão das ações do sistema nervoso autônomo sobre a função dos órgãos do trato geniturinário, com a hipótese de que a 6-ND é um importante modulador endógeno da função renal, vesical, prostática e erétil em condições fisiológicas e patológicas. Nossos estudos preliminares mostraram a liberação de 6-ND em bexiga de camundongos e uma potente resposta relaxante in vitro da musculatura lisa da bexiga, uretra, próstata e corpo cavernoso. Assim, o objetivo do projeto é: i) determinar as concentrações de 6-ND, bem como noradrenalina (NOR), adrenalina (ADR) e DA em amostras de rim, bexiga, uretra, próstata e corpo cavernoso isoladas de camundongo e humano; ii) caracterizar as ações da 6-ND in vitro sobre as vias contráteis e iii) relaxantes de bexiga, uretra, próstata e corpo cavernoso isoladas de camundongo; iv) in vivo, avaliar a função renal e miccional (gaiola metabólica, técnica de papel de filtro e cistometria) e v) erétil (pressão intracavernosa) em camundongos após tratamento agudo ou crônico com 6-ND; e vi) determinar a geração de nucleotídeos cíclicos (AMPc e GMPc) na presença de 6-ND, NOR, ADR e DA, em diferentes tempos e concentrações, em amostras de bexiga, uretra, próstata e corpo cavernoso isoladas de camundongo e humano; vii) em modelo de injúria renal induzida por bloqueio crônico da produção de NO por L-NAME em ratos e camundongos, avaliar as alterações hemodinâmicas, a diurese, albuminuria e alterações histológicas dos rins. A investigação dos efeitos da 6-ND permitirá uma melhor avaliação de sua importância fisiopatológica e potencial terapêutico.

A anorexia nervosa (AN) é um distúrbio alimentar que afeta prevalentemente mulheres na adolescência, caracterizada pela extrema perda de peso, distorção da imagem corporal e restrição calórica. Apesar de sua etiologia ainda não ser bem estabelecida, sabe-se que eventos estressantes e traumas na infância podem aumentar a susceptibilidade aos transtornos alimentares. Um possível modelo animal para estudo deste distúrbio é a privação materna neonatal, a qual possui impacto direto sobre o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) alterando a resposta do animal ao estresse na vida adulta, além da predisposição ao desenvolvimento de transtornos psiquiátricos, como ansiedade, depressão e distúrbios alimentares. A privação em animais CD-1 no dia pós-natal 9 (DPN9) resulta em um menor peso corporal quando esses atingem a idade adulta, menor exploração no centro no teste de campo aberto, um aumento dos níveis basais de ACTH plasmático e do turnover serotoninérgico. Além disso, há uma regulação negativa da transcrição do mRNA do hormônio liberador de corticotrofina (CRH) no núcleo paraventricular do hipotálamo e da pró-opiomelanocortina (POMC) na hipófise. Também se constatou um aumento significativo nos níveis de óxido nítrico (NO) no córtex pré-frontal e hipocampo em ratos Wistar machos e fêmeas. Dentro deste contexto, a via do óxido nítrico (NO) recebe destaque, pois este é um metabólito envolvido na regulação da ingestão alimentar e apetite, além de um importante neurotransmissor, neuromodulador e mediador de processos imunológicos. O NO pode ser sintetizado a partir de três isoformas da enzima óxido nítrico sintase: a endotelial (eNOS), a neuronial (nNOS) e a induzível (iNOS). Estudos demonstram que a síntese de NO é aumentada em pacientes com AN e que a expressão da nNOS encontra-se aumentada em animais que passaram pela separação materna. Partindo desse pressuposto, o presente projeto visa avaliar se a exposição de camundongos CD-1 ao estresse de privação materna neonatal aumenta a susceptibilidade ao desenvolvimento de comportamentos relacionados à AN por um aumento da atividade da nNOS e se esse quadro pode ser revertido em animais tratados com 7-Nitroindazol, droga inibidora desta enzima. Sendo assim, a análise destes mecanismos corroboraria para elucidação de uma das facetas envolvidas na etiopatogenia da Anorexia Nervosa, salientando o papel da programação neonatal no desenvolvimento de transtornos psiquiátricos ao longo do crescimento do indivíduo.

Na pré-eclâmpsia (PE), a hipóxia e a isquemia placentárias geradas pelo ineficiente desenvolvimento das artérias espiraladas devido a falha na invasão dos trofoblastos irá causar a disfunção placentária e, consequentemente, a disfunção endotelial materna generalizada. Com isso, a placenta disfuncional libera fatores anti-angiogênicos, antígenos pró-inflamatórios e espécies reativas de oxigênio (ROS). Além disso, o estresse oxidativo também é evidenciado pela redução de enzimas antioxidantes e pelo desacoplamento da enzima produtora de NO, chamada de eNOS (endothelial NO synthase). Foi por esses fatores que o presente estudo supõe que o nebivolol, um fármaco anti-hipertensivo com efeitos antioxidantes, pode ser reposicionado para tratar a pré-eclâmpsia, propondo uma terapia segura e acessível para esta condição que não dispõe de tratamento farmacológico efetivo. Para isso, será utilizado o método de Redução da Pressão de Perfusão Uteroplacentária (RUPP) de indução a pré-eclâmpsia em 32 ratas Wistar, sendo estas divididas nos seguintes grupos: 1. Ratas prenhes normotensas tratadas com solução salina; 2. Ratas prenhes hipertensas tratadas com solução salina; 3; Ratas prenhes normotensas tratadas com nebivolol 10 mg/kg/dia; 4. Ratas prenhes hipertensas tratadas com nebivolol 10 mg/kg/dia. O procedimento cirúrgico RUPP e a eutanásia serão realizados no 14º e 21º dia gestacional, respectivamente. Amostras dos órgãos reprodutores maternos e de artérias maternas serão coletadas a fim de se analisar o efeito do fármaco na hipertensão gestacional e estresse oxidativo.

Estudos epidemiológicos apontam uma associação entre anemia falciforme edisfunção miccional, mas os mecanismos fisiopatológicos envolvidos permanecem poucocompreendidos. Há somente quatro estudos experimentais voltado à compreensão dadisfunção miccional na anemia falciforme, e por isso a fisiopatologia ainda é poucoexplorada. Em modelo animal, o excesso de espécies reativas de oxigênio no tratourinário inferior parece contribuir para a disfunção miccional. Em modelo animalde bexiga hiperativa, estudo prévio mostrou que camundongos machos deficientes de NOapresentam hipertrofia e hiperatividade detrusora. Entretanto, na anemia falciformeas alterações moleculares da via de sinalização de contração e relaxamento na bexiga foipouco explorada, assim como o estresse oxidativo. O objetivo desse projeto é investigaras principais proteínas que participam da contração e relaxamento do músculo lisodetrusor de camundongos falciformes.

O grupo de pesquisa do Prof. Newton Canteras (ICB-USP) tem sugerido que a liberação de NO na PAG pode influenciar mecanismos de defesa e do medo frente a uma ameaça predatória. Sendo assim, o monitoramento da dinâmica de formação do NO durante a exposição de um rato a um predador poderia ser útil para uma melhor compreensão do fenômeno de defesa frente a agressões e, neste contexto, a possibilidade de inserção de um sensor de NO no cérebro de um rato seria fundamental para testar a hipótese. Para que os dados possam ser obtidos e transmitidos trabalhando-se com animais em livre movimento, a resposta do potenciostato miniaturizado deve ser testada e validada para as condições que irá enfrentar.

O diabetes mellitus é considerado hoje um dos maiores problemas de saúde mundial do século XXI. A neuropatia diabética periférica é a complicação crônica mais comum do diabetes mellitus tipo 1, com grande variedade de manifestações clínicas. Afeta atualmente 60% daqueles acometidos por este tipo de diabetes e é caracterizada por expressivo dano aos nervos periféricos. O tipo mais comum e prevalente é o que apresenta uma disfunção sensitiva - motora dos membros inferiores, apresentando quadro severo de dor decorrente da neuropatia crônica desenvolvida pelo quadro de hiperglicemia.As opções terapêuticas para o controle da dor têm aumentado nos últimos anos. Entretanto, as respostas aos tratamentos convencionais (como medicamentos) não sãos satisfatórias, resultando em afastamentos laborais e da sociedade, afetando assim a qualidade de vida do indivíduo. Fotobioestimulação é o uso da luz como terapia (FBM), é um método não-invasivo que tem demonstrado tanto na pesquisa básica, como na pesquisa clínica ser eficaz na redução da sensibilidade à dor e consequentemente na melhoria da qualidade de vida de pacientes. Já está claro que os cromóforos que absorvem a luz emitida pelo tratamento de FBM, interagem com citocromo C oxidase, resultando no aumento do metabolismo celular através do aumento da síntese de ATP pelas mitocôndrias. Ainda, a irradiação de luz nas mitocôndrias pode ocasionar a fotodissociação de óxido nítrico (NO) do citocromo c oxidase (CCO). O óxido nítrico mitocondrial desloca oxigênio do complexo IV (CCO) resultando em uma regulação negativa do processo de respiração celular e consequentemente uma diminuição na síntese de ATP. Ao induzir o referido efeito de fotodissociação de óxido nítrico do complexo IV, a irradiação laser previne o deslocamento de oxigênio do citocromo c oxidase, permitindo desta forma uma regulação positiva no metabolismo mitocondrial. O presente projeto visa examinar o papel do tratamento com fotobiomodulação no modelo de diabetes mellitus tipo 1 induzida por injeção de streptozotocina- STZ, investigando os possíveis genes ligados à atividade mitocondria e o possível papel do óxido nítrico após tratamento com a terapia. A avaliação e a compreensão de estratégias especificamente direcionadas para modular e estudar a fisiologia da diabetes pode representar uma ferramenta poderosa para ajudar a ciência e o manejo clínico deste tipo de dor.

Nesse projeto pretende-se desenvolver microeletrodos para a detecção de NO. A superfície dos dispositivos será modificada empregando-se camadas de cobalto(II)tetra(3,4-piridil)porfirazina (TRP), as quais serão imobilizadas por dip-coating ou eletropolimerização. Uma vez que o NO coexiste comoutras substâncias eletroativas em meio biológico, protocolos de proteção da superfície do sensorserão examinados para restringir a passagem dos interferentes. Curvas de calibração serão construídas com o objetivo de estabelecer uma correlação entre a corrente medida com o microeletrodo e a concentração de NO em solução. Outros parâmetros analíticos relevantes como repetibilidade,reprodutibilidade e limite de detecção também serão determinados para avaliar o desempenho dosensor. A aplicação prática do sensor será examinada pela detecção de NO em cultura de macrófagosde ratos, e o correto posicionamento do microeletrodo será feito com o auxílio de um microscópioeletroquímico (SECM).

Está bem estabelecido que as células endoteliais modulam a reatividade vascular através da liberação de mediadores como prostaciclina óxido nítrico e endotelina. As catecolaminas modulam o tônus vascular por meio das ações nos ±- e ²-adrenérgicos entretanto, a produção e a liberação de catecolaminas estão associadas à existência de terminais nervosos nos vasos. A dopamina um neurotransmissor bem conhecido no sistema nervoso central, também é um modulador importante da pressão arterial, equilíbrio de sódio e função renal e função adrenal e é relevante para a patogênese e / ou manutenção de hipertensão. Curiosamente, derivados de dopamina, como araquidonoil-dopamina tem foram encontrados no sistema nervoso central. Ele atua como um agonista endógeno dos receptores canabinóides. Outro derivado da dopamina, 6-nitro-dopamina, também foi identificado a liberação basal em vasos do cordão humano (HUCV) no qual atua antagonizando receptores D2-like e também em ducto canal deferente de rato como agonista contrátil que e antagonizados por antidepressivos tricíclicos. Nitrocatecolaminas, como nitronoradrenalina e nitroadrenalina, foram extraídas do cérebro de ratos e quantificadas por detecção de reação de quimioluminescência de LC-peroxoxalato e 6-nitronoradrenalina inibiu o transporte de noradrenalina em sinaptossomas de ratos. Nesse estudo ira avaliar a liberação e mecanismo fisiológico das nitro-catecolaminas: 6-nitrodopamina, 6-nitronoradrenalina e 6-nitroadrenalina no sitema cardiovascular.

Objetivos: Capacitar o bolsista para manutenção de camundongos transgênicos, e de técnicas laboratoriais, como extração de DNA, reação de PCR e eletroforese em gel de agarose. Duas tarefas específicas e complementares serão de responsabilidade do bolsista: (i) capacitação sobre normas de segurança e cuidados na manipulação de animais; (ii) genotipagem dos animais.Plano de trabalho: O bolsista será responsável por manter o biotério nas condições ideais (segundo as normas do comitê de ética) de limpeza, iluminação e umidade, além dos cuidados com os animais: distribuição e limpeza das caixas, manutenção de água e comida, reprodução e sexagem. Será estabelecida uma rotina onde as tarefas acima descritas serão distribuídas durante a semana. Inicialmente o bolsista receberá treinamento e capacitação inicial sobre as normas de biossegurança do laboratório e sobre o uso e manipulação de animais de experimentação.Genotipagem: O bolsista será responsável pelo cruzamento de camundongos knockouts ou transgênicos (formação de casais e troca das caixas), coleta de amostras, extração de DNA, reação de PCR e eletroforese em gel de agarose. Após a realização de todas essas etapas, será possível a identificação do genótipo dos animais. Tarefas como: preparo de soluções, processamento de tecidos coletados para a realização de diversas, além de participar das discussões científicas do laboratório, também farão parte da rotina do bolsista.Metodologia a ser empregada: O screening inicial para identificação do animal se dará por meio da utilização da técnica de PCR, com primers específicos para os alvos. Para isso os animais no momento do desmame serão numerados por cortes nas orelhas, seguindo padrão internacional. Na sequência será retirado um pequeno pedaço da porção distal da cauda para extração de DNA. Os tecidos serão lisados com o acréscimo de 200uL de tampão de lise (pH 8,0) acrescido de proteinase K (Life Technologies), na proporção de 1,5mg/mL de solução (Tampão de Lise: Tris HCl 50 mM pH 8,0; EDTA 10 mM pH 8,0; SDS 0,5%; H2O MiliQ; Proteinase K 1,5 mg/mL). A solução será mantida por 2 horas em banho-maria à 65oC para otimizar a lise celular. Após esse período, adiciona-se 200uL do tampão de lise sem proteinase K, e mantem-se em temperatura ambiente por 15 minutos. Após, as amostras serão centrifugadas (11.000 RPM, 4oC, 20 minutos). Para precipitação do DNA, cerca de 300uL do sobrenadante será transferido para outro tubo contendo 400uL de etanol absoluto e 20uL de acetato de sódio 3M. As amostras serão novamente centrifugadas (6.000 RPM, 4oC, 10 minutos), o sobrenadante descartado e o precipitado lavado com etanol 70%. Após lavagem e nova centrifugação, o pellet será diluído com 200uL de TE pH 7,5 (Tris HCl 10 mM e EDTA 1mM). A solubilização do DNA será realizada em banho maria a 65oC, por 30 minutos, e sua quantificação 260/280 nm será realizada no aparelho NanoDrop, Life Technologies, utilizando diluição de 1:20 em TE. Será feito um gel de agarose e as bandas detectadas de acordo com o peso molecular dos alvos. As linhagens de animais knockouts ou transgênicos que serão mantidas são: CX3cr1-Cre, CSFR1-Cre, TRPV1 KO, TLR4KO, iNOS KO. Além da manutenção de cada linhagem, os animais deverão ser cruzados entre si para a obtenção dos animais de interesse.